Eigenkontrolle von Reinigungs- und Desinfektionsverfahren Mikroorganismen und Keimzahl auf Oberflächen bestimmen

Das wfk-Institut in Krefeld entwickelt ein neues Verfahren zur biochemischen Synchronbestimmung hygienerelevanter Mikroorganismen und der Gesamtkeimzahl auf Oberflächen im Rahmen einer Eigenkontrolle.In hygienisch anspruchsvollen Bereichen (zum Beispiel Lebensmittel- und Pharmaindustrie, Kosmetik- und Gesundheitsbereich) sind Hygiene-Qualitätsmanagementsysteme (QMS) von großer Bedeutung, da die hygienischen Anforderungen stetig steigen. Wichtige Bestandteile dieser QM-Systeme sind Hygiene- und Desinfektionspläne, in denen regelmäßige Reinigungs- und Flächendesinfektionsmaßnahmen festgelegt werden. Zur Überprüfung der Qualität solcher Reinigungs- und Desinfektionsverfahren werden routinemäßig stichprobenartige Endproduktkontrollen vorgenommen. Derzeit werden Abklatschplatten zur Beprobung der Oberflächen verwendet, die von externen mikrobiologischen Fachlaboratorien inkubiert und ausgewertet werden müssen. Dabei erfolgt sowohl eine Bestimmung der Gesamtkeimzahl als auch eine Bestimmung einzelner hygienerelevanter Mikroorganismen (zum Beispiel Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus hirae). Diese externe Auswertung erfordert einen Zeitraum von mindestens zwei Tagen und verursacht hohe Kosten. Verfahren, die zeitnah eine Bestimmung hygienerelevanter Mikroorganismen sowie der Gesamtkeimzahl auf Oberflächen im Rahmen einer Eigenkontrolle ermöglichen, stehen derzeit nicht zur Verfügung. Im Rahmen eines Forschungsprojekts des wfk – Cleaning Technology Institute wird ein neues Verfahren zur biochemischen Synchronbestimmung hygienerelevanter Mikroorganismen und der Gesamtkeimzahl auf Oberflächen im Rahmen einer Eigenkontrolle entwickelt. Für das Verfahren der biochemischen Synchronbestimmung werden auf einem Probenträger thermoresponsive Polymerbürsten immobilisiert. Unter einer Polymerbürste ist hierbei eine dichte Schicht von Polymerketten zu verstehen, die ähnlich den Borsten auf einer Bürste an einem Probenträger fixiert sind. Die thermoresponsiven Polymerketten innerhalb der Polymerbürste kontrahieren durch eine Temperaturerhöhung in Richtung des Probenträgers. Zur unspezifischen Bindung eines breiten Spektrums an Mikroorganismen werden die Polymerbürsten mit Lektinen (Kohlenhydratstrukturen-bindende Proteine, zum Beispiel in mikrobiellen Zellwänden) funktionalisiert. Bei einer Oberflächenbeprobung mit den beschriebenen Probenträgern sorgt die hohe Beweglichkeit der Polymerbürsten dafür, dass auch Mikroorganismen in unzugänglicheren Oberflächenbereichen erreicht werden können und eine effektive Bindung an den funktionalisierten Polymerbürsten erfolgen kann (siehe Abb. 1a). Bei Abnahme der Probenträger von der Oberfläche wird die Thermoresponsivität der Polymerbürsten zur Erhöhung der Stabilität des Systems genutzt. Durch einen kurzen Temperaturreiz (zum Beispiel durch eine Wärmelampe) verkürzt und verdichtet sich die Polymerbürste in Richtung des Probenträgers und löst dabei die Mikroorganismen von der Oberfläche ab (siehe Abb. 1b). Zur Visualisierung und Quantifizierung der gebundenen Mikroorganismen wird die Polymerbürste mit unterschiedlich fluoreszierenden Quantum Dots (nanoskalige Halbleiterkristalle) inkubiert. Die Quantum Dots werden entweder so funktionalisiert, dass sie unspezifisch ein breites Spektrum von Mikroorganismen (Lektin-Funktionalisierung) oder mit hoher Selektivität ausgewählte, hygienerelevante Mikroorganismen über bestimmte Antigene (Antikörper-Funktionalisierung) binden (siehe Abb. 2). Durch die starke Fluoreszenz der Quantum Dots können markierte Mikroorganismen durch Auszählen (zum Beispiel mittels Handmikroskop) quantifiziert werden. Hierbei ist es möglich, die Bestimmung hygienerelevanter Mikroorganismen (zum Beispiel Inkubation mit rot fluoreszierenden Antikörper-funktionalisierten Quantum Dots) und der Gesamtkeimzahl (zum Beispiel anschließende Inkubation mit blau fluoreszierenden Lektin-funktionalisierten Quantum Dots) auf demselben Probenträger innerhalb von maximal zwei Stunden durchzuführen. Das Verfahren zur biochemischen Synchronbestimmung hygienerelevanter Mikroorganismen und der Gesamtkeimzahl auf Oberflächen wird eine zeitnahe Überprüfung von Reinigungs- und Desinfektionsmaßnahmen im Rahmen einer Eigenkontrolle ermöglichen. Dadurch können Korrekturmaßnahmen ohne große zeitliche Verzögerung durchgeführt und zeit- und kostenintensive Auswertungen durch externe mikrobiologische Fachlaboratorien minimiert werden. Im Rahmen bisheriger Untersuchungen der Forschungsstelle konnten bereits thermoresponsive Polymerbürsten auf unterschiedlichen Probenträgern aufgebracht werden. Hierfür wurden UV-aktive Startermoleküle kovalent an die Probenträgeroberflächen gebunden. Anschließend wurden diese mit einer Lösung von N-Isopropylacrylamid (NiPAAm) überschichtet und im Folgenden durch UV-Bestrahlung thermoresponsive Polymerbürsten auf der Oberfläche hergestellt. Diese zeigen eine Übergangstemperatur von rund 32 Grad Celsius. In weiteren Untersuchungen konnten ferner geeignete Lektine identifiziert werden, die im immobilisierten Zustand ein breites Spektrum lebender Mikroorganismen binden. Als besonders geeignet erwiesen sich das Lektin Wheat Germ Agglutinin (WGA) für die Bindung von Bakterien und Concanavalin A (ConA) für die Bindung von Hefen. Diese Lektine wurden genutzt, um sowohl rot als auch grün fluoreszierende Quantum Dots zu funktionalisieren und Mikroorganismen anzufärben. Bei den roten Lektin-funktionalisierten Quantum Dots konnten bei Bakterien und Hefen sehr gute Signale detektiert werden (siehe Abb. 3). Die grün fluoreszierenden Lektin-funktionalisierten Quantum Dots zeigten nur bei der Hefe ein deutlich sichtbares Signal. Zur spezifischen Bestimmung der Mikroorganismen wurden Antikörper verwendet. Es wurden ebenfalls rot und grün fluoreszierende Quantum Dots mit den Spezies-spezifischen Antikörpern funktionalisiert und die entsprechenden Mikroorganismen angefärbt. Ein gutes Signal wird mit den roten Antikörper-funktionalisierten Quantum Dots generiert. Parallel zur Etablierung der Färbetechniken wurden die entwickelten thermoresponsiven Polymerbürsten mit WGA und ConA kovalent funktionalisiert. Erste Beprobungen von angeschmutzten Testmonitoren aus befilmten Bodenbelägen zeigten, dass eine Abnahme von Mikroorganismen mit den funktionalisierten Polymerbürsten und eine adäquate Färbung dieser Mikroorganismen mit funktionalisierten Quantum Dots auf den Oberflächen der Polymerbürsten möglich ist. Derzeit laufen Versuchsreihen zur Optimierung der Beprobung von strukturierten Oberflächen. Für weitere Informationen zu diesem Forschungsprojekt und zur Teilnahme am projektbegleitenden Ausschuss kontaktieren Sie bitte das wfk – Cleaning Technology Institute e.V. (info@wfk.de). Dr. Sabrina Kolbe | markus.targiel@holzmann-medien.de

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